1. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
И.В. Лядова
IV Школа по клинической иммунологии,
Пушкинские Горы, 27 января – 2 февраля 2013

2. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Mycobacterium tuberculosis – внутриклеточная бактерия,
паразитирующая в макрофагах.
Инфицирование M. tuberculosis происходит через
респираторный тракт.
Начальные этапы инфицирования:
Инфицирование АМ и ДК
Миграция в дистальные отделы легкого, некроз АМ и
ДК
Инфицирование паренхимальных фагоцитов
Продукция провоспалительных ЦК и ХК
Миграция иммунных клеток (нейтрофилов, моноцитов,
лимфоцитов) в фокус инфекции
Начало образования гранулемы

3. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Лимфатические узлы:
Миграция ДК в лимфатические узлы
Инициация Т-клеточного ответа (Th1)
Миграция эффекторных Т-лимфоцитов в фокус инфекции
Фокус инфекции:
«Дозревание» эффекторных Т-лимфоцитов
Продукция ХК
-миграция новых иммунных клеток в фокус инфекции
- формирование гранулемы
-ограничение фокуса инфекции
Продукция эффекторных ЦК
-активация макрофагов
- продукция АФК, АФА – киллинг / подавление Mtb
- усиление Т-клеточного ответа
- формирование гранулемы

4. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Результат:
Полный клиренс микобактерий (здоровье)
Контроль над Mtb (латентная инфекция, не
контагиозна, не требует лечения?)
Развитие заболевания – туберкулез (заболевание,
контагиозно, требует длительного и дорогостоящего
лечения)
Инфильтративный ТБ
Туберкулема
Кавернозный ТБ
Фиброзно-кавернозный ТБ
Казеозная пневмония

5. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Инфекция M. tuberculosis
Клиренс Туберкулез Контроль над
Mtb: Mtb:
Латентная
Здоровье
инфекция
•Очаговый
•Кавернозный
•Туберкулома
•Диссеминированный
•Казеозная пневмония

6. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Инфекция M. tuberculosis
5-10%
Клиренс Туберкулез Латентная
инфекция
•8,7 млн новых случаев 1/3 населения
заболевания ТБ в год
•1,4 млн смертей от ТБ
WHO Global Tuberculosis Report 2012
http://www.who.int/tb/publications/global_report/en
/

7. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Диагностика
Диагностика ТБ
Диагностика инфицирования
Дифференциальная диагностика
заболевания и латентной инфекции
Оценка активности инфекционного
процесса

8. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Методы Основные ограничения
Микробиологические • Необходимость получения мокроты
и молекулярно- • Отсутствие Mtb в мокроте не
биологические позволяет исключить диагноз ТБ
(недостаточная чувствительность)
Лучевые • Отсутствие специфичности
• Субъективная оценка результатов
Клинические • Отсутствие специфичности
• Субъективная оценка результатов

9. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Основные проблемы в области диагностики ТБ - процессы,
не сопровождающиеся выраженной деструкцией легочной
ткани, выделением мокроты, присутствием в мокроте Mtb
(ограниченные процессы, диссеминированные заболевания
легких).
Скрининговые тесты.
Основные требования к разрабатываемым методам:
высокая специфичность
анализ доступных биологических образцов (кровь)
доступность (цена, сложность).

10. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Метод Основные ограничения
Тесты in vivo
• Ограничения тестов in vivo
Туберкулиновая • Возможность сенсибилизации
проба (Манту) • Ограничение использования у детей с
аллергическими заболеваниями….
Антиген:
•Перекрестная реактивность с BCG
туберкулин
•Большой процент
ложноотрицательных и
ложноположительных результатов
•положительные результаты при ЛТИ?
Диаскинтест
Антигены: Основные преимущества
ESAT6/CFP10 • Отсутствие перекрестной
- Отсутствуют в реактивности с BCG
BCG • Отрицательные результаты при ЛТИ -
- Секреторные ????

11. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Метод Основные ограничения
Тесты in vitro
Серологические тесты • Низкая чувствительность и
(идентификация специфичность (50-70%)
антител к антигенам
Mtb)
Клеточные тесты
QFT
T-SPOT
Новые подходы

12. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Клеточные тесты диагностики и мониторинга
ТБ:
1. Интерфероновые тесты
(Interferon-Gamma release Assays - IGRAs)

13. ПринципИ.В., IV Всероссийскаялимфоцитов,
Лядова метода: детекция школа по клинической иммунологии, 2013г.
специфичных к антигенам Mtb (по продукции IFN-)
Нет инфекции Туберкулез
IGRAs Стимуляция Детекция
QuantiFERON-TB- Клетки крови + Аг Концентрация IFN-γ
GOLD (ESAT6/CFP10/T7.7) (ИФА)
T-SPOT Клетки крови + Аг Частота IFN-γ+
(ESAT6/CFP10) клеток (ELISPOT)
(цитометрия)

14. QuantiFERON-TB Gold in tube assay клинической иммунологии, 2013г.
Лядова И.В., IV Всероссийская школа по
• контроль
• Mtb -Аг:
ESAT6,
CFP10,
TB7.7
• Митоген
Критерии оценки результатов:
Положительный:
Проба с Аг - контроль
> 0.35 ед/мл, > 25%
Отрицательный:
Проба с Аг - контроль < 0.35
ед/мл, > 25%
Ответ на митоген

15. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Ограничения интерфероновых тестов
Нет инфекции Латентная Туберкулез
инфекция
?
Стимуляция
Чувствительность Супрессия иммунного ответа,
снижение чувствительности метода
Специфичность Увеличение количества IFN-
продуцирующих клеток при
латентной инфекции

16. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Информативность теста QuantiFERON-TB-GOLD по
данным литературы: чувствительность
Чувствительность (больные ТБ, HIV-): 60 -90%
QFT, % T-SPOT, %
89 97
85 92
81 96
74 93
70 95

17. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Информативность теста QuantiFERON-TB-GOLD по
данным литературы: специфичность
Shablon et al., BMC Infect Dis. 2011;11:245.
Германия, 180 студентов-медиков (отсутствие контакта)
QFT-: 178.
Специфичность: 99%
Pai et al., JAMA, 2005,293, No. 22
Индия. 726 здоровых (ТБ) медицинских работника
QFT-: 436
Cпецифичность: 60%
Результаты теста зависели от возраста и длительности
работы в сфере здравоохранения, т.е. от риска
инфицирования.

18. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Тест QuantiFERON-TB-GOLD: ограничения
оложительные результаты QFT среди здорового населения
наблюдается в странах с высокой распространенностью ТБ.
ывод: Метод диагностирует инфицирование и не позволяет
дифференцировать ЛТИ и ТБ
ледствия:
Специфичность и диагностическая ценность метода могут быть
разными в разных странах и регионах.
В связи с этим 2011 г. ВОЗ НЕ рекомендовала к использованию
«Интерфероновые» тесты в странах с низким и средним доходом
(высоким риском распространения латентной инфекции).
Нужны методы дифф. диагностики ЛТИ и ТБ.

19. РезультатыIV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Лядова И.В., собственных исследований
Обследовано:
• 52 пациента с диагнозом ТБ легких
• 25 «здоровых» доноров (из них 2 с диагнозом пневмония и
бронхит)
• 32 сотрудников ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН (группа высокого риска
инфицирования, «латентно-инфицированные»)

20. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Больны Здоровые Контакты Здоровые Больные +
е + контакты
Контакты
Всего 52 25 32 57 84
QFN+ 32 4 13 17 45
QFN- 20 21 19 40 39
Чувствительность 62% 62% 54%
Специфичность 84% 70% 84%

21. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Всего Диагноз ТБ Диагноз: Диагноз ТБ
остаточные снят
изменения
Всего 111 48 9 54
QFT+ 45 36 2 7
QFT- 66 12 7 47
Чувствительность 75%
Специфичность 87%
ППЦ 84%
ОПЦ 71%

22. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Всего Диагноз ТБ Диагноз: ТБ
остаточные инфициров
изменения ание
Всего 56 26 5 25
QFT+ 27 23 0 4
QFT- 29 3 5 21
Чувствительность 88%
Специфичность 84%
ППЦ 85%
ОПЦ 72%

23. СравнениеIV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Лядова И.В.,
и интерпретация результатов
QuantiFERON и Диаскинтеста
Принципы постановки диагноза у детей с учетом теста ДСТ:
Реакция Манту ДСТ Диагноз
положит положит ТБ
положит отрицат ЛТИ
Интерпретация результатов QFT:
Реакция Манту QFT Диагноз
положит ТБ или ЛТИ
Конкордантность результатов ДСТ и QFT >90%

24. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
1. Отсутствие “золотого стандарта” диагностики
латентной инфекции Mtb
2. «Произвольная» интерпретация результатов тестов
ДСТ и QFT

25. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Диагностика активного ТБ и латентной
инфекции:
1. «Усовершенствование» QFT (замена IFN-)
2. Поиск клеточных маркеров

26. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Биомаркеры в супернатантах культур теста QuantiFERON
EGF, MIP-1 (Chegou et al., 2009, BMC Pulm Med)
IP-10 (Bogstrom et al., 2012, PLOS One)
IFN-γ, IP-10, MIG (Wang et al., Tuberculosis, 2012)
Вопросы и замечания:
1. Отсутствие валидации предлагаемых критериев на отдельной когорте.
2. Использование в качестве диагностического критерия уровня
продукции фактора в пробах, не стимулированных специфическим
антигеном. Как обеспечивается специфичность предлагаемого теста?
3. Выбор больных (все – БК+, диагностика ТБ у таких больных
трудностей не представляет).

27. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Диагностика активного ТБ и латентной
инфекции:
Клеточные маркеры.
Количественное определение Mtb-
специфичных лимфоцитов методом
проточной цитометрии

28. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Harari A. et al. Dominant TNF-α+ Mycobacterium tuberculosis–
specific CD4+ T cell responses discriminate between latent
infection and active disease. Nature Medicine, 2011, 17: 372.
283 человека с подозрением на ТБ: 11 - ТБ, 272 - ЛТИ

29. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Многоцветная проточная цитометрия: сравнение процента
IFN-+, IL-2+, TNF-+ и полифункциональных клеток у
больных и ЛТИ
Harari A. et al. Dominant TNF-
α+ Mycobacterium tuberculosis–
specific CD4+ T cell responses
discriminate between latent
infection and active disease.
Nature Medicine, 2011, 17: 372.
Антигены:
ESAT6, CFP10, PPD
Mtb-реактивные Т клетки:
IFN-+
IL-2+
TNF-+
IFN-+ IL-2+ TNF-+

30. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Полифункциональные и TNF-+ Т-лимфоциты у
больных и ЛТИ
37.4%
Порог 37,4% разделяет больных ТБ и ЛТИ с:
Чувствительностью: 100%
Специфичностью - 96%

31. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Определение процента TNF-+ CD4+ Т-лимфоцитов в
крови позволяет дифференцировать ТБ и ЛТИ
Пороговое значение TNF-+ клеток 37.4% разделяло больных и
ЛТИ:
Чувствительность: 100%
Специфичность: 96%
Валидационные исследования:
>37,4% - 15 человек (подтверждение диагноза - 12)
<37,4% - 79 человек (подтверждение ЛТИ - 73 человека)
Чувствительность: 67%
Специфичность: 96%
Обе когорты:
Чувствительность: 67%
Специфичность: 92.4%
Положительная предсказательная ценность: 82%
Отрицательная предсказательная ценность: 92%

32. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Процент ПФ и TNF-+ CD4+ Т-лимфоцитов в крови
изменяется в процессе лечения

33. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Выводы и вопросы
Заключение авторов: Анализ цитокинового профиля Mtb-
специфичных лимфоцитов CD4+ с помощью многоцветной
проточной цитометрии является основным иммунологическим
методом дискриминации активного ТБ и ЛТИ.
(Our results indicate that the analysis of cytokine profiles in Mtb-specific CD4+ T
cells by polychromatic flow cytometry is a major immunological measure
discriminating between active and latent Mtb infection).
Вопросы
1. Диагностика ТБ, не сопровождающегося деструкцией легочной ткани.
2. Различия между IFN-, TNF--продуцирующими и
полифункциональными клетками?

34. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Streitz et al. Tuberculin-Specific T Cells Are Reduced in Active
PulmonarуTuberculosis Compared to LTBI or Status Post BCG Vaccination. J.
Inf. Dis. 2010201, 203:378.
ТБ - 21 человек, ЛТИ - 17 человек
Антиген: PPD
Mtb-реактивные Т клетки:
IFN-+
IL-2+
TNF-+
CD154
CD107
ТБ ЛТИ
У больных снижено
процентное содержание
клеток эффекторов
IFN+, CD107+
ТБ ЛТИ

35. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Streitz et al. Tuberculin-Specific T Cells Are Reduced in Active
PulmonarуTuberculosis Compared to LTBI or Status Post BCG Vaccination. J.
Inf. Dis. 2011
Среди Mtb-реактивных
клеток у больных
повышено содержание
TNF-+ и CD154+
Streitz et al., The Journal of Infectious Diseases 2010;203:378–382

36. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Диагностика активного ТБ и латентной
инфекции:
Оценка дифференцировочного статуса
Mtb-специфичных лимфоцитов

37. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
 Рассмотренные ранее подходы –
 анализ количества Mtb-специфичных Т-
эффекторов (ПЦ) или их ответа (ИФА,
мультиплексный анализ)
 Предлагаемый подход:
 анализ состояния Mtb-специфичных лимфоцитов
: определение степени их дифференцировки

38. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Дифференцировка эффекторных лимфоцитов
сопровождается сменой поверхностного фенотипа
Лимф. узел Периферия
Аг
TN TЕ TЕ TЕ TЕ
CD62L+ CD62L- CD62L- CD62L- CD62L-
CD27+ CD27+ CD27+ CD27- CD27-
CD28+ CD28+
CD28+ CD28- CD28+
CD57- CD57-
CD57- CD57- CD57+

39. Образование эффекторов CD4+CD27- из иммунологии, 2013г.
Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической
эффекторов CD4+CD27+
TЕ TЕ
CD27+ CD27-
(TNFR-SF) (TNFR-SF)
Результаты эксериментальных исследований на мышах:
Дифференцировка эффекторов CD27+  CD27-:
• может происходить непосредственно в легочной ткани
• зависит от Аг и провоспалительных ЦК
• CD27- эффекторы накапливаются преимущественно в легочной
ткани (J. Immunol. 2007).
Предположение:
Степень дифференцировки CD27+  CD27- (% CD27-) может отражать
активность ТБ инфекции
Lyadova et al., Clin. Exp. Immunol., 2004
Kapina et al., J. Immunol., 2007

40. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Определение содержания эффекторов CD27- в
популяции Mtb-специфичных лимфоцитов CD4
Группы: Больные ТБ (n=66), здоровые (n=15), ТБ контакты (n=22)
Метод:
Цельная кровь + PPD = идентификация Mtb-реактивных клеток (IFN-+),
Определение процента CD27-
Nikitina et al., PLOS ONE, 2012

41. Больные ТБ Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Лядова И.В., IV
и ТБ контакты (ЛТИ) не отличаются по
проценту клеток IFN-+
Процент клеток IFN-+
среди лимфоцитов CD4+
0.5
1.50 p<0.05 p<0.05
1.25 0.4
IFN-+клетки, %
IFN-+клетки, %
1.00
0.3
0.75
0.2
0.50
0.25 0.1
0.00
0.0
здоровые контакты больные ТБ
здоровые контакты больные ТБ
Содержание Mtb-реактивных
(IFN-+) лимфоцитов CD4 у
больных и ТБ контактов
достоверно не отличается.

42. Больные ТБ Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Лядова И.В., IV
и ТБ контакты (ЛТИ) отличаются по
проценту клеток CD27- среди Mtb-специфичных (IFN-+)
лимфоцитов CD4
Процент клеток CD27-  Степень
среди лимфоцитов дифференцировки Mtb-
CD4+IFN-+ специфичных лимфоцитов
p<0.0005
CD4 (%CD27-) различается
100 p<0.0001 у больных и здоровых
людей (здоровые+ТБ
IFN-+CD27- клетки,%
80
контакты).
60
40
 Дифференциальная
диагностика ТБ и ЛТИ?
20
0
здоровые контакты больные ТБ
Nikitina et al., PLOS ONE, 2012

43. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Степень дифференцировки Mtb-специфичных (IFN-+)
лимфоцитов CD4 (%CD27-) отличает больных ТБ и ТБ
контактов (ЛТИ)
100 AUC = 0.89
чувствительность, %
80
P<0.0001
Порог 31.2%
60 Чувствительность - 82%
Специфичность - 91%
40
20
0
0 20 40 60 80 100
100% - специфичность%
Nikitina et al., PLOS ONE, 2012

44. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Использование теста «Mtb-CD27» для
диагностики ТБ у больных с
ограниченными процессами в легочной
ткани?

45. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Тест “Mtb-CD27” может дифференцировать людей с
ЛТИ и больных без признаков деструкции легочной
ткани
Больные без деструкций и ТБ контакты Больные БК- и ТБ контакты
125 125
100 100
Sensitivity %
Sensitivity %
75 75
50 50
25 nc=21 25 nc=21
nБ=14 nБ=7
0 0
0 25 50 75 100 0 25 50 75 100
100% - Specificity% 100% - Specificity%
AUC = 0.77 AUC = 0.88
P<0.008 P<0.003
Порог 31.2% Порог 31.2%
Чувствительность - 71% Чувствительность - 71%
Специфичность - 90% Специфичность - 91%

46. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Заключение
Определение степени дифференцировки
эффекторных лимфоцитов, циркулирующих в крови -
•метод, позволяющий оценивать активность
инфекционного (воспалительного) процесса
непосредственно в очаге инфекции.
• Почему?

47. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Степень дифференцировки Mtb-специфичных лимфоцитов,
циркулирующих в крови, варьирует (12-92%),
Nikitina et al., PLOS ONE, 2012

48. Степень дифференцировки Mtb-специфичных лимфоцитов,
Корреляционные связи между процентным содержанием Mtb-
Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
специфичных лимфоцитов CD27- и характеристиками ТБ легких
циркулирующих в крови, связана со степенью деструкции
легочной ткани
Корреляция по
Факторы Множественная линейная регрессия, 3
Спирмену
n rho p-value Estimate Std. error t-value p-value
Деструкция легочной ткани 64 0.66 5x10-9 5.8296 2.0309 2.870 0.00578
Клиническая тяжесть 64 0.55 3.2x10-6 6.0474 2.5473 2.374 0.02105
Патологические изменения в
64 0.5 3.4x10-5 1.7958 2.2448 0.800 0.4270
ОАК
Наличие Mtb в мокроте 64 0.36 0.004 -0.2399 2.5495 -0.094 0.92538
Распространенность ТБ
64 0.38 0.002 1.1142 2.0340 0.548 0.5860
Наличие лекарственной
устойчивости
64 0.28 0.04 н/о н/о н/о н/о
Длительность ТБ 64 0.28 0.02 н/о н/о н/о н/о

49. Содержание Mtb-специфичных CD27- лимфоцитов
Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
более 47% позволяет идентифицировать больных с
множественными полостями деструкции
ROC-кривая
Чувствительность %
100
ч увствительность %
80
60
40
20 AUC=0.89
p<0.0001
0
0 20 40 60 80 100
100% - специфичность%
Порог= 47%,
AUC=0.89, p<0.0001
Чувствительность 89 %
Специфичность 74 %
Nikitina et al., PLOS ONE, 2012

50. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Степень дифференцировки Mtb-специфичных лимфоцитов,
циркулирующих в крови, варьирует (12-92%), находящихся в
легких = всегда высокая (Ю75%).
Кровь Легкие
12%-92% >75%
Nikitina et al., PLOS ONE, 2012

51. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.

52. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Заключение
Определение степени дифференцировки (%CD27-)
эффекторных лимфоцитов, циркулирующих в крови,
позволяет оценивать степень деструкции в легочной
ткани.
Использование аналогичного подхода при других
заболеваниях?

53. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Заключение. Проблемы и вопросы в области
диагностики ТБ.
1. Отсутствие «золотого стандарта» диагностики
инфицирования Mtb.
2. Отсутствие единообразия в интерпретации тестов
QFT и ДСТ.
3. Необходимость в методах дифференциальной
диагностики активного ТБ и ЛТИ, методах оценки
активности ТБ инфекции.
4. Перспективные направления:
1. Анализ TNFa-продуцирующих лимфоцитов
2. Анализ CD27- лимфоцитов.

54. Лядова И.В., IV Всероссийская школа по клинической иммунологии, 2013г.
Спасибо за внимание!